Екологична микробиология


Категория на документа: Биология


1 въпрос: Методи за изследване екологията на микроорганизмите.Отделяне на микроорганизмите от екологичните ниши и проблеми, свързани с некултивируемите форми.Преки методи за оцветяване на проби от вода, почва и отпадъци. Преки методи за оценка на метаболитната активност на клетките. Молекулярно-генетични методи. Метод на обратна транскрипция

Отделяне на микроорганизмите от екологични ниши и проблеми, свързани с некултивируемите форми.
Според някои оценки, изследователите могат да обработват по-малко от 0,1% от всички микроорганизми. Десетки хиляди видове микроорганизми, които живеят като симбионти на животни и растения трябва да бъдат отделени и идентифицирани. Въпреки, че много от тези микроорганизми принадлежат към т. нар. "некултивируеми" и по този начин са недостъпни за класически микробиологични методи за идентификация, има няколко начина, които позволяват да се оцени тяхното многообразие и разпространение. Такива методи съчетават пряко наблюдение под микроскоп и различни техники, основани на молекулярната диагностика, включително и диагностика на последователността на генома, кодиращ синтеза на молекулата на 16S рРНК

Преки методи за оцветяване на различни проби от вода, почви и отпадъци – позволяват да се отделят много повече живи клетки, отколкото при отглеждането им в различни среди. Голямата разлика в резултатите от директното отчитане в сравнение с отглеждането в хранителна среда поставя въпроса: оцветените микроорганизми се явяват живи или мъртви? Промяната в качеството на оцветителя акридиново оранжево показва, че част от клетките се оцветяват с последваща зелена флуоресценция, а част - остават оранжеви. Това е довело първоначално до погрешното заключение. че зелените клетки са живи, а оранжевите - мъртви. Впоследствие се изяснило, че цвета на флуоресценция зависи от съотношението на ДНК / белтък в клетката. Активно делящите се клетки изглеждат зелени, а тези които растат по-бавно, а също и почиващите дават оранжева флуоресценция, при което също остават живи.

Разработени са и преки методи за директна оценка на метаболитната клетъчна активност (клетъчното дишане), които позволяват да се разграничат живи клетки от мъртви в естествените проби. Методите се основават на използването на различни соли (тетразолиум), които при възстановяване в клетката на дехидрогеназата (дихателната активност) се превръщат в неразтворим формазан ( с червен цвят), който може да бъде открит визуално под микроскоп Има начин да се направи разграничение между живите, мъртвите и увредени клетки с измерване състоянието на мембранния потенциал с помощта на флуорохром. Друг метод предлага да се добави към пробата на живи клетки инхибитор на клетъчното делене ( налидиксова киселина), като активно растящите клетки ще се удължават, без влизане в етап на двукомпонентно ( бинарно) делене.

Възможно е, много микроорганизми, наблюдавани с микроскоп като живи, да са встъпили в състояние на " некултивируема форма на бактерии (НФБ)”. Тази идея беше предложена от американски микробиолог проф. Р. Колвел през 1987 г. Показано е, че част от клетките на природни образци не дават колонии в лабораторни среди, въпреки че в природата те водят активен начин на живот и патогенни форми съхраняват своята вирулентност по отношение на животните. Експериментите ясно показали , че такива човешки патогени като Legionella pneumophila. Salmonella enteritidis. Vibrio cholerae и V.vulnifikus постоянно образуват НФБ в природните екониши Става ясно значението на преките микроскопски наблюдения на естествените проби за откриване на патогени.

За да се наблюдават некултивируеми форми на микроорганизми в природните образци се използват методи на молекулярния анализ ( молекулярно-генетични методи). Разработени са няколко десетки диагностични проби – последователност на ДНК / РНК за специфичното откриване на определени видове, родове, семейства или таксони от по-висок порядък непосредствено в природните образци.

С използването на тези последователности било открито, че морските води, съдържат много видове архебактерии и бактерии , които не се поддават на култивиране ( отглеждане) в лабораторията.

Олигонуклеотидните проби с дължина 18 - 20 нуклеотида са най-подходящи за такава диагностика, тъй като те лесно се хибридизират със специфични участъци от ДНК на конкретния организъм.

Дори и малки количества от некултивируемите форми могат да бъдат намерени в популациите на природни образци с помощта на ПЦР – усилване на диагностическите последователности на ДНК.

Жизнеспособните клетки на микроорганизмите могат да бъдат идентифицирани също с помощта на специфичен за и РНК метод на обратна транскрипция, но при използването на този метод трябва да се помни, че живота на някои бактериални и РНК може да бъде по-малко от минута.

2 въпрос: Изучаване активността на микроорганизмите в природата. Микроелектроди. Радиоизотопи. Стабилни изотопи

Микроелектроди - Тъй като микробите са много малки, малка е и тяхната микросреда (обкръжение) За размера на клетката от 3 микрона и микрообкръжение на разстояние от 3 мм съответства разстояние 2 км за човека. Експериментаторите са разработили специални миниатюрни електроди с диаметър до 2 - 3 микрона, които позволяват да се проникне в микросредата на клетките в природните екониши и провеждане на измерване на рН , Еh, солеността, температурата, съдържанието на кислород или на някои химични елементи (Na +. K +, HS , NH4, N20, т.н.). Също така са разработени миниатюрни спектрорадиометри, които позволяват качествено измерване на поглъщане на светлината в микронишите, което е важно при изучаване на структурата и функцията на циано - бактериални постелки и други микробни общности. Микроелектроди се използват интензивно при изучаване на циано-бактериални общности, по повърхността на които се развиват цианобактерии и водорасли, които са основни продуценти на постелката, на дълбочината, на която светлината е лимитиращ фактор. Проследено е, че на дълбочина от 1,0 - 1,2 мм от постелката (ако общата дебелина около 2 см) фотосинтезата престава (и общността става анаеробна). С това рязко се повишава нивото на концентрацията на сероводород, което възниква като резултат от дейността на сулфатредуктори в ниските слоеве на постелката (в този пример се разглежда структурата на постелката на морските местообитания). Концентрацията на сероводород във всеки слой от съобществата - резултат на балансиран процес от неговото отделяне от сулфатредукторите и от неговото потребление от фототрофи и тионови или безцветни серни бактерии.

Радиоизотопи.
Методи за измерване на активността на микроорганизмите в техните естествени местообитания или пресни проби с използване на радиоизотопи са най-чувствителни от всички. Тези техники могат да хвърлят светлина върху съдбата на субстрат в микробни общности на определени екониши. За измерване на интензитета на фотосинтезата се използва метод за измерване с включването на белязан 14CO2. като има и контролна "тъмна" проба. За отчитане и измерване на скоростта на сулфатредукцията се използват серни изотопи ( SО4) , които се превръщат в H2S . Скоростта на метаногенезата може да се проследи по превръщането на СО2 в CH4 при наличието на значителни количества водород или по трансформацията на 14C- метанола, метилираните амини, или ацетата в 14СН4. Хемоорганотрофната активност може да се измери по скоростта на включване на белязаните с 14 C органични съединения ( често за тези цели се използва глюкоза или аминокиселина)
Ефектът на органичната материя може да се определи и по отделянето на 14 CO2 от белязаните с 14С органични субстрати. Във всички случаи, при определяне на скоростта на процесите на консумация на изотопа или неговото отделяне е необходимо да се отчита съотношението между белязаните и небелязаните субстрати, внесени в пробата за отчитане на специфичната активност на потребление на субстрата или съединенията на продуктите.

Експерименти с радиоактивни изотопи се използват широко в микробната екология. В разнородни природни местообитания, винаги могат да преминат и химически преобразувания на субстрати, необходимо е да се осъществят паралелно опити, със съответните контролни проби, основните от които са проби от мъртви клетки. За тази цел, често използват формалдехид в концентрация от 4% или изварени проби.

Стабилни изотопи. Тъй като повечето от биогенните елементи имат изотопи, стабилни и радиоактивни, е възможно да се проучи активността на микроорганизмите в естествените проби с използването на така наречен "изотопен ефект", същността на който се свежда до това, че живите клетки са способни да използват диференцирано леките и тежките изотопи на един и същ елемент в биологическите трансформации. В микробната екология най-широко разпространени са изследванията, свързани с преобразуването на изотопите на C и S. Въглеродът в природата е представен главно под формата на изотоп 12C, въпреки че се среща и под формата на тежката форма 13C, както и радиоактивната форма - 14C. По същия начин, по-голямата част от серни съединения се състоят главно от 32S, въпреки че се среща и стабилният изотоп 34S и радиоактивният изотоп 35S. Повечето биохимични реакции, протичащи в живи клетки, са в състояние да изберат по-лекия изотоп, от тези които са в наличност. Ето защо, съединения с по-тежки изотопи остават неактивни и техния относителен дял в останалите субстрати се увеличава ,а в продукта - се намалява. Това явление се нарича“фракциониране на изотопите”.

В изследване на проби от различен произход, беше установено, че най-"тежки" на въглерод са морските карбонати ( с химически произход) със съотношение на
13 C= ± 5‰ Неотдавнашни (геологически) морски утайки имат 13 C= -10 ... 35 ‰, което показва участието на микроорганизми в тяхното формиране. Биомасата на растения има дефицит на 13 С - 12 ... 25 ‰ , нефт - 20 ... 35‰, метан - 25 ... 80 ‰ ! Интересно е да се отбележи, че скалните пластове с възраст около 3,5 милиарда години (времето на възникването на живота на Земята) са изчерпани откъм 13C - 12 - 22‰ , което свидетелства за много ранната поява на автотрафи на планетата. Подобни измервания, извършвани в рамките на серни изотопи, показаха, че в метеоритния сулфид 35S = -3 до + 3 ‰ , в залежите на елементарна сяра са - 18 ... + 18‰ , а сулфидите в морските утайки могат да имат 35S до -30% о , което показва значително складиране на сулфатредуктори в процеса на глобалния кръговрат на сярата.

За да се разбере структурата и функционирането на екосистемите, освен малко информация за взаимоотношенията в микробните общности, също така са необходими и количествени данни за броя на микробите на едно общество, биомасата на популациите, нивото на биологичната активност, деленето на клетки и тяхното умиране, както и скоростта на оборота на възникващите цикли от кръговрата на веществата в екосистемата. Количество, биомаса и активност - това са екологическите параметри, които, макар и взаимосвързани, не трябва да се разглеждат като взаимозаменяеми. Обикновено природата сама диктува решимите екологичните проблеми и кои от тези параметри трябва да се измерват, а техническите трудности заставят изследователите да измерват броя на клетките и след това и относителния параметър - биомасата. След изчисленията, е необходимо да се отнесем с критичност към резултатите като се разсъждава за приемливи изводи при всички условия на експеримента. Методите, използвани в тези измервания са основа за определяне на микробна екология като научна дисциплина, както и общото разбиране на екологията на микробите. Прилагането на количествен подход повече от всичко отделя еколозите от природозащитниците.

3 въпрос: Събиране на образци от почви, вода, отпадъци, въздух и биологически образци

За да се изследва броя и дейността на микробните популации в различните екосистеми са разработени множество методологически подходи. В проучването на микроорганизмите в природни образци (общият брой, броя на съобществата, техните метаболитни активности ) представителните части на пробата се анализират и резултатите се проектират върху съобществото като цяло или върху екосистемата. Терминът "репрезентативен (представителен) " означава, че пробата трябва да отразява разнообразието и плътността на организмите с общо местообитание, откъдето са взети пробите. В много местообитания, разпространението на микроорганизмите не е хомогенно, а по-скоро групирано.
Ето защо, всяка взета проба, разбира се, точна по отношение на изучаваното местообитание - пространството може да съдържа много и малко микроорганизми, което води до неправилно екстраполиране на резултатите. Това е особено вярно за микроорганизми, които живеят в условията на микросредата, за която експериментаторът по време на вземане на проби и не предполага. Обработка на сложни образци, приготвени от събрани индивидуални проби, с използване на специални смесители, може да сведе до минимум грешките. Данните, съответстващи
на съответните проби за всички екониши трябва да бъдат подкрепени от статистически анализ .
Важно е да се помни, че всяко измерване се състои от три фази:
1) събиране на проби 2) подготовка на проби 3) правилно измерване. При тълкуването на резултатите трябва да бъдат критично разглеждани всички три етапа от обработката на пробите.

При събирането на проби от такива сложни и разнообразни местообитания, като червата на животните, на повърхностния слой на почвата, водата на езеро, дълбоководни утайки на моретата се използват различни подходи. Невъзможността плътно да се приближим до мястото на вземане на проби води до това, че се измислят различни начини за дистанционно вземане на проби.

Методите за вземане на проби и тяхното съхранение не трябва да се променят количеството на клетки или тяхната активност. Изследователят трябва да е сигурен, че избраните проби са представителни и не са замърсени с външни микроорганизми, така че методът за вземане на проби трябва да гарантира че микроорганизмите в пробата са само от желаното местообитание.

Пробите от почвата обикновено са подбрани , съблюдавайки с минималната асептичност, тъй като броят на микроорганизмите в повърхностните хоризонти е многократно по-голям, отколкото във въздуха или нестерилни (но чисти!) контейнери за проба. За да се събират проби от значителна дълбочина се избира ядро, което се пробива ръчно или с помощта на специални механизми, и вътре в ядрото се намира нужната зона и вече се работи асептично в лабораторията.



Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Екологична микробиология 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.