Микробиологична диагностика на грам-отрицателни неферментативни бактерии Pseudomonas


Категория на документа: Биология




Реферат на тема

Микробиологична диагностика на Грам-отрицателни неферментативни бактерии. Pseudomonas

Изготвил: Веселина Радушева

Грам-отрицателните неферментативни бактерии са облигатни аероби, Грам (-) бактерии или кокобактерии, които растат добре на обикновени хранителни среди (МПБ, МПА, кръвен агар), а значителна част и на селективни среди за Enterobacteriaceae - агар на МакКонки, Ендо, Левин и др. Не разлагат въглехидратите или ги разлагат оксидативно с образуването на киселина без газ. Повечето са условно патогенни и могат да причинят епидемични заболявания, особено ВБИ (вътреболнични инфекции ). Към групата спадат родовете Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Alcaligenes и др. Могат да се намерят във всички клинико-микробиологични материали - хемокултури, ликвори, урокултури, раневи, гнойни, ушни и очни секрети, храчки, а също и в обекти на вътреболничната среда - апаратура, инструментариум и др.

Pseudomonas са представители от сем. Pseudomonadaceae, включващо 191 описани вида. Те първоначално са били класифицирани в края на 19-ти век, когато за първи път са идентифицирани от Walter Migula. Неферментативни Грам (-), gama-протеобактерии. Характерна група, срещаща се в околната среда. Имат висока устойчивост във външната среда, особено в обекти с висока влажност. Повече от 70 вида, които се срещат в почва, води, растения ( напр. P. syringae - растителен патоген), болнична среда. Играят важна роля в разграждането на органичната материя. Облигатни аероби. Пръчковидни, неспорообразуващи. Херманоорганотрофи. Имат респираторен метаболизъм, могат да използват различни субстрати. Биват подвижни , с един или повече (предимно два, три) флагелума и неподвижни. Като неподвижните образуват микроколонии, обкръжени от гликокаликс. Бактериалния гликокаликс предпазва от фагоцитоза и от свързване на антитела срещу О- и Н- антигените. Играе важна роля и за адхезията към тъканите и органите ( напр. към муцина на белите дробове). Повечето предизвикват β-хемолиза. Често около растежа се наблюдава пигментиране - синьо-зелено (50 % от видовете), което се дължи на фенезиновия пигмент пиоцианин (разтворим във вода и хлороформ; образува се само от P.aeruginosa). Пиоцианина оцветява гнойните секрети в синьо. Продуцират и други пигменти: пиовердин ( кафяво-червен пигмент) - таксономичен белег за другите видове на р. Pseudomonas, пиорубин (червеникав пигмент), пиомеланин / флуоресцин ( кафяв пигмент); флуоресцентно жълто-зелен сидерофор; Някои видове Pseudomonas могат да продуцират допълнителни видове на сидерофори, като пиохелина при Pseudomonas aeruginosa и тиоквинолобактин при Pseudomonas fluorescens.
Неферментативни са, защото разграждат слабо захари ( глюкоза, рибоза, глюконат). На среда Хю-Лайфсон разграждат оскъдно глюкозата без отделяне на газ. На среда на Симонс използват амониевия цитрат като единствен източник на въглерод и енергия; редуцират нитратите до газообразен азот:
NO3- + 2 H+ + 2 e- → NO2- + H2O
NO2- + H+ + e- → NO + OH-
2 NO + 2 H+ + 2 e- → N2O + H2O
N2O + 2 H+ + 2 e- → N2 + H2O

Оксидазо-положителни и каталазо-положителни. Оксидазите имат важна роля в ЕТВ при аеробното дишане. Напр. цитохром оксидазата спомага за окислението на цитохром С от молекула О2, при което се получава Н2О и окислен цитохром. Катализира образуването на супероксидни йони и водороден прекис - микробоцидно действие. Каталазата от своя страна предотвратява образуването на водороден пероксид (Н2О2), получаващ се при контакт на редуцираните флавопротеини с О2 на въздуха:
2Н2О2→ 2Н2О + О2
Разграждат желатина. По Фогес-Проскауер са отрицателни. Тест за метилово червено отрицателен. Индол (-), Н2S (-). Характерно за Р.fluorescens е, че расте при 4 оС, а P.aeruginosa при 42 оС. Останалите представители могат да се развиват или само на ниски или на високи температури.
Част от тях са патогенни. Опортюнистични инфекции причиняват: P.aeruginosa ( третият по честота след S.aureus и E.coli причинител на вътреболнични инфекции - ВБИ; на първо място по фатални случаи при кистозна фиброза, неопластични инфекции и изгаряния), P.putida, P. stutzeri, P. alcaligenes, P. flurescens и др. Облигатно патогенни са P. mallei ( причинителят на сап при животните) и P. pseudomallei. Заболявания предизвикват и други представители като P. maltophilia (Xanthomonas maltophilia / Stenotrophomonas maltophilia) и P. cepacia.
P.aeruginosa
P.aeruginosa е най-добре изученият вид от рода псевдомонади. Грам (-) пръчковидна бактерия с размери 0,5 - 0,8 мкм ширина и 1,5 - 3 мкм дължина. Облигатен аероб, не расте в анаеробни условия. Не образуват спори. Подвижен е, има силно подвижен монотрих, но единични щамове могат да имат 2-3 полярни ресни. Продуцира полизахаридно капсулоподобно вещество, слайм (гликокаликс, мукоид), съставен от алгинат. Притежава липополизахарид (ендотоксин) във външната си мембрана. По-слабо биологично активен е, защото липид А от липополизахарида не притежава β-хидроксимаслена киселина, в сравнение с ендотоксина при ентеробактериите.
P.aeruginosa расте на разлини органични субстрати - има големи възможности за обитание: почва, прясна вода, апаратура - умивалници, инструментариум, вани, кранове, чешми и др., част от НМФ на човека (гастроинтестиналния тракт). Развива се добре във влажна среда. Това е предпоставка за развитието му и предизвикването му на ВБИ. Бързорастящ , невзискателен към среди. Развива се в граници на 10-42 оС , като оптималната температура е 35 оС. Способността му да се развива на 42 оС се използва като диференциално-диагностичен белег. В комбинация със способността да образува биофилм, те са в състояние да оцелеят в разнообразие от неочаквани места. Просто източник на въглерод, като сапунен остатък или капачка линейно-лепило е подходящо място за да растат добре. Други необичайни места, където са били намерени включват антисептици, като четвъртични амониеви съединения, както и бутилирана минерална вода.

Култивира се обикновено на кръвен агар и слабо селективни среди за изолиране на чревни бактерии - МакКонки, Левин и др. Тъканни течности, кръв, аспирати и др. се посяват на течна среда на Тароци. При ВБИ с насочено търсене на на P.aeruginosa се използват специални хранителни среди, съдържащи цитрамид, налидиксова киселина, трифенилтетразолхлорид и др. На МПА образува два вида колонии - S-колонии (плоски, големи, влажни, понякога с метален блясък) и рядко R-колонии. Средата се оцветява от жълтозелено до синьозелено, понякога до тъмнокафяво и черно. Продуцира ароматни вещества (аминоацетофени), поради което има мирис на липа. В течни среди (МПБ) расте с дифузна матнина и лигава ципа на повърхността.
Характерно свойство на бактерията е да синтезира пигмента -пиоцианин, както и пиоцини и аеругеноцини ( тава са бактериоцини - белтъчни антибактериални съединения, като цяло са катионни пептиди, които показват хидрофобни или амфифилни свойства и бактериалната мембрана в повечето случаи е цел за дейността им.). Има 3 вида пиоцини: R-пиоцините наподобяват морфологично опашките на контрактилните фаги и се различават от пръчковидните; флексибелни F-пиоцини (над 90%); 70% са S-пиоцините.
Важен патогенен фактор е екзотоксин А, който е сходен с дифтерния, и се продуцира след започване на инфекцията. Той блокира белтъчния синтез (елонгация на полипептида) чрез NAD-зависимо-ADP-рибосимиране на транслоказата EF-1. Токсинът се продуцира в неактивна форма и се активира чрез протеолитично разцепване. Състои се от фрагмент А, който има токсично действие, и фрагмент Б , който се свързва с рецептора на клетката и навлиза в тях чрез ендоцитоза. Екзотоксин А действа предимно върху чернодробни клетки.
P.aeruginosa продуцира и други токсини (ендо- и екзотоксини), както и ензими. Голяма част от щамовете продуцират екзополизахариди, представляващи анионни полимери, които образуват около клетката капсулоподобни слоеве. Те протектират бактериите от защитните механизми на организма. Действат като адхезини и водят до образуването в бактерията на прилепнали към клетките му микроколонии с обвити в екзополизахариден гликокаликс микроби, като в тази си форма микроорганисма е устойчив на антибиотици.
Ендотоксина, който се продуцира, е фактор, неутрализиращ действието на комплемента и фагоцитозата; играе важна роля в установяването на инфекцията. Доказателство за това е силното действие на О-антигена. Цитотоксина ( т.нар. левкоцидин) уврежда левкоцитите, но и някои други клетки. Екзоензим S инхибира белтачния синтез като препятства фагоцитната бактерицидия. Хемолизините увреждат мембранмата на клетките, разграждат лицитина и липидите в тях. Подпомагат тъканната деструкция. Предизвиква неркоза, ателектази. Биват термолабилни с лецитиназна активност (фосфолипаза С), които разграждат лицитина в мембраната на еритроцитите чрез отцепване на фосфохолин и термостабилни с гликолипидна природа, които имат детергенно действие върху мембраната. Протеазите ( алкална фосфатаза, еластаза) са фактори на инвазията. Еластазата при белодробните инфекции усилва действието на ексотоксин А, а заедно с еластазата при корнеалните инфекции разгражда IgG, някои фактори на комплимента и кръвосъсирващата система. Бактериите притежават поне 3 различни протеази, като L-протеазата позволява по-дългото им преживяване в кръвния поток; Пиохелина от своя страна има функция на сидерофор като образува токсичния хидроксилен радикал. Продуцира неураминидаза, която отстранява силовите участъци от клетъчните рецептори и подпомага клетъчната адхезия. Разгражда и фиброниктина в епителните клетки на лигавицата, което спомага за адхеренцията на други Грам (-) бактерии..
Антигенен строеж: съдържа О-антигени (липополизахаридни) и Н-антигени. Използват се в реакция на аглутинация на Губер за групиране и типизиране на различни щамове. На базата на О-антигените са разработени ваксини за профилактика на псевдомонас инфекциите. Слаймът също има антигенен характер.
Генетична структура: псевдомонадите са богати на гуанин и цитозин ( 67% съдържание). Могат да съдържат различни извънхромозомни или допълнителни елементи, като плазмиди, бактериофаги, транспозони. Известни са множество фаги, които паразитират върху P.aeruginosa.
Биохимични характеристики: На кръвен агар предизвиква хемолиза (често β-хемолиза), на МакКонки е лактозо-отрицателен, образува амоняк, който повишава рН на агара и води до образуване на безцветни / леко жълтеникави колонии. На МПБ се образува дифузна мътница и лигава ципа на повърхността (аеробен растеж), която трудно се хемогенизира. Под ципата се образува жълтозелен до сивосин оцветен слой. Образувалият се пигмент - пиоцианин - може да се докаже с няколко капки хлороформ; пиоцианинът се екстрахира от хлороформа и капчиците хлороформ на дъното на епруветката се оцветяват в синьозелено. Може да се използва и среда King B , която стимулира продукцията на пиоцианин. Поради добрата си водоразтворимост, той дифундира в средата и я оцветява в синьо-зелено.
P.aeruginosa е неферментативен микроорганизъм и на среда на Клиглер расте без да променя цвета на средата. На среда на Хю-Лайфсон в 2 епруветки (едната се оставя в аеробни условия при оптимална температура, а другата - на кипяща вода за отстраняване на разтворения кислород в средата и покрита с течен парафин ), първоначално зелената среда пожълтява само в епруветката без парафин, култивирана в аеробни условия; т.е. имаме разграждане на глюкозата - оксидация; а при ферментация имаме пожълтяване в двете епруветки.
Оксидазо-положителен е , като способността на бактериите да продуцират цитохром оксидаза може да се установи чрез прибавяне на оксидазен тест-реагент ( тетраметил-ф-фенилендиамин дихидрохлорид) към растящата култура. Реагентът ( светло розов на цвят) служи като субстрат доставящ електрони и се окислява, при което цвета му се променя в тъмно лилаво. След известно време става автоокисление на реактивите. Оксидазния тест се използва за разграничаване на р. Pseudomonas и р. Neisseria от р. Enterobacteriaceae. Има положителна каталазна реакция, като продукцията може да се установи чрез прибавяне на субстрат Н2О2 към културата. При активност започва отделяне на мехурчета О2.
Усвоява цитрата по Симонс, редуцира нитратите в нитрити до отделяне на газ под форма на молекула азот. Използва се среда богата на KNO3 като източник на нитрат. При редукция на нитратите се появяват молекули газообразен азот в газоуловителите. Като при наличието на нитрити, след добавянето на сулфанова к-на и α-нафтиламин, средата се оцветява в червено. Бързо разводнява желатина. Индол (-), Н2S (-). Хидролизира млечния казеин - високо молекулен млечен протеин, неспособен да премине през цитоплазматичната мембрана. Върху млечен агар образува протеолетична зона около колониите.
Има липазна и фосфолипазна активност, т.е. може да разгражда триглицериди и фосфолопиди. За липазната реакция се използва трибутил-агар. Образуват се зони на просветляване около колониите - зони на диполиза.

CH2 - COOR CH2 - OH
│ │ RCOOH
CH - COOR → CH - OH + RCOOH
│ │ RCOOH
CH2 - COOR CH2 - OH
Фосфатидилхолина се разгражда до диацил-глицерол и фосфолилхолин, който всъщност оцветява средата. Използва се децитин-агар. Положителната реакция се характеризира с образуването мътнобели, диглицеридни зони около колониите в резултат на хидролизата на яйчения екстракт.
Аргинин-дехидролаза положителен , но орнитин и лизин декарбоксилаза отрицателен.
> Микробиологична идентификация:
Използват се раневи секрети, гнойни, кръв, урина, храчки, жлъчка, ликвор; при ВБИ апаратура, предмети от стаи, превързочни материали и др. Приготвят се микроскопски препарати по Грам, като се наблюдават Грам (-), тънки, прави или леко извити пръчици, разположени поединично. Подвижни монотрихи - една (рядко две) полярно разположена ресна. Подвижността може да се наблюдава с фазов контраст или препарат висяща капка. Извършват се посевки върху МПА, кръвен агар, диференциращи и селективни среди, цитрамит агар. Диференцира се чрез ОF-тестове ( Хю-Лайфсон тест), оксидазна реакция, образуване на пиоцианин, способност за растеж при 42 оС.
P.aeruginosa е силно адаптивен сапрофит, причиняващ опортюнистични инфекции; условно патогенен е. Честият причинител на хоспиталните инфекции; при онкологично болните честотата му е висока. Бактериятa участва и при различни хирургически инфекции, възпаления на външното и средното ухо, очни и кожни инфекции (при къпане в инфектирани басейни); голяма роля при цистичната фиброза ( муковисцидоза) - автозомно-рецисивно заболяване, характеризиращо се с хиперсекреция. Води до пневмония, бактериемия, , инфекции на белите дробове, пикочните пътища и бъбреците. Той е един от причинителите на менингити и особено у новородени, при които липсват IgM, а IgG, постъпили от майката, бързо изчезват.
Симптомите при бактериемията, предизвикана от P.aeruginosa може да варират от слабо проявление до животозастрашаващи състояния, в зависимост от засегнатите органи и защитните сили на организма и могат да включват повишена телесна температура, втрисане, мускулни болки, болки в ставите и други. Възможните усложнения при бактериемия, предизвикана от псевдомонас аеругиноза могат да бъдат ендокардит, остеомиелит, кожни инфекции, язви, инфекции на ушите, менингит, енцефалит, ендофталмит, пневмония, перитонит, нагноителни процеси и други.
Източник на бактериемията, предизвикана от P.aeruginosa могат да бъдат замърсена вода, почва, както и хора и животни, носители на инфекцията.
Лечението се извършва с различни антибиотици: карбеницилин, тозуфлоксацин, темафлоксацин, ципрофлоксацин, гентамицин, цефоперазен и др. Естествено резистентни на пеницилин и по-голямата част от свързаните бета-лактамни антибиотици, но някои са чувствителни към пиперацилин, имипенем, тикарцилин, тобрамицин, или ципрофлоксацин. Има ниска антибиотична чувствителност. Тази ниска чувствителност се дължи на съгласуваните действия на множествените ефлуксни помпи - които изпомпват някои антибиотици преди антибиотиците да са започнали да действат - с хромозомно кодирани гени за антибиотична резистентност (напр. mexAB, oprM, mexXY и др.) и ниска пропускливост на бактериалните клетъчни пакети.



Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Микробиологична диагностика на грам-отрицателни неферментативни бактерии Pseudomonas 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.