Екологична микробиология


Категория на документа: Биология


За вземане на проби от почвените микроорганизми, които са в сравнително малки количества се използват "атрактанти" или "примамка". В някои случаи, в почвата се пуска чисто стъкло или стъкло със специфична среда агар-агар, върху които се развиват необходимите микроорганизми (стъклото обраства според Холодной) Чистите стъкла, които не притежават селективни свойства се използват за отчитане на прикрепените микроорганизмите в почвата или утайки. В този случай, стъклото е аналогично на минералните частици на почвата (кварц) и отразява микробното разнообразие неселективно.

Друг вариант на стъклообрастване се явяват плоскопаралелните капиляри, които първо са разработени от Перфилев. Те се наричат също педоскопи, когато са потопени в почвата и пелоскопи - при потапяне в дънни утайки. Капилярите са отворени в двата края, и микроорганизми могат да се движат свободно в тях. Често капилярите заливат средата (аттрактант), селективно до определена физиологична групи микроорганизми . Предимството на плоски капиляри е в това, че тяхното съдържимо може да се види под микроскоп пряко , а плоската стена свежда до минимум изкривяването и пречупване на светлината, минаваща през капилярите.

Прилагане на капилярите на Порфилев позволява да се правят наблюдения за развитието на почвената или утаечна микробиота (микробоценоза), дава възможност за провеждане на непрекъснато (с автоматични кинокамери, проектирани за определен брой снимки на час или на ден) проучване на микробните популации, без страх от изсушаване на препарата, увеличава полето за действие на експериментатора с въвеждането на различни хранителни вещества от единия край на капиляра , като по този начин го прави протичащ. Такива капиляри позволяват да се проследи развитието на анаеробни съобщества, без използването на сложни технологии на анаеробно отглеждане. Капилярите помагат да се наблюдава живота в екосистемите в естествени условия, без нарушаване на тяхната цялост, както и да се откриват необичайни морфологични форми на все още некултивирани микроорганизми.

Различни са разработени методи за събиране на проби от вода. Проблеми с избора на водни проби е обикновено по-голяма, отколкото с почвени проби, тъй като почти винаги водните проби са избрани на значително разстояние от експериментатора. При това възникват проблеми със спазването на стерилност, защото откритите водни пространства съдържат малко микроорганизми и тези проби може лесно да замърсяват с неестествена микробиота устройството за вземане на проби. Всяка от разработените сонди има своите предимства и недостатъци. Често, целта на създаването на много сложни устройства е увереността,че водните проби действително са избрани от желаното място, например с дълбочина 100 м. Сред моделите, разработени за водните проби са следните:
■ вакумирани бутилки, които се пълнят с вода при определена дълбочина с помощта на тежести, разбиващи водозасмукващите капиляри;
■ стерилен пластмасов пакет, отварящ се с помощта на пружини на определена дълбочина след като се спусне от повърхността тежеста, която едновременно провежда в движение пружината и бръснача, разкриващ отвор в пакета;
■ сонда, с укрепени на различни дълбочини стерилни спринцовки, в които едновременно се засмукват проби вода.

Такива устройства обикновено се използват за събиране на проби от повърхностни стратифицирани езера. При дълбоководните проби трябва да се предвиди възможността за декомпресия на организми, по време на изкачване на повърхността. Разработените модели за водни проби дават възможност да се отварят и затварят входните отвори на дълбочина, без да се позволи на налягането вътре в извадката да пада при изкачването.

Пробите от утайки обикновено са избрани от повърхността с помощта на стъргало или кофи, но тези методи не позволяват да се опазят данните от извадките от замърсяване с микроорганизми.. Спазвайки асептичност могат да се вземат проби-ядра, които след това в лабораторията в стерилни условия, разделени във вертикална посока, което позволява да се проследи динамиката на утайките в хоризонтално положение. Най-точно избрани образци от морски утайки се събират с помощта на миниатюрни дву- или триместна подводница, която се потапя на дълбочина до 3 км, където с помощта на манипулатори и специални свредели се вземат проби от утайки в точно локализиран участък (това е особено важно в местата с подводни термални извори или "черни пушачи"). Използването на мини-подводница позволява също така да се събират проби и да се обработват в нужния вид на мястото, от което са събрани ( например да се вкарат радиоизотопи) и да се оставят на място за инкубация с последващо изваждане на повърхността за анализ.

Събирането на проби от въздуха е необходимо да се извършва при използването на апарати, които минимално наранят живите клетки на микроорганизми, които обикновено са в малки капчици във въздуха. Пасивната седиментация, която позволява да се изчисли количеството на постоянните клетки на микроорганизмите (и формирането на колониите) на повърхността на Петриева чаша с агар-агар среда, е подходяща за преброяване на броя на спорите, но не за количествено отчитане на бактериите във въздуха.. Повечето от пробите на въздуха се вземат като се пропуска определен обем от него през бактериални филтри,чиито пори имат размер, който може да варира и това дава възможност за диференциация по размер на микроорганизмите от въздуха . Някои прибори (устройства) (апарат на Кротов) са проектирани така, че те насочват потока от въздух, засмукан при вземане на проби, на повърхността на Петриевата паничка с агар-агар среда, върху която както се смята се утаяват всички частици, суспендирани във въздуха, включително и микроорганизмите.

Биологични проби от растения или животни включват събирането на биологични течности (растителен сок, кръв, урина, лимфата, слюнката ), екскрети (фекален) или проби от повърхността на обекта, както и вътрешните органи (биопсия). Повърхността на микроорганизмите, се измиват и изчистват със стерилен буферен разтвор или физиологичен разтвор (0,85% разтвор на NaCl в дестилирана вода) с помощта на стерилен памучен тампон.. В други случаи, микроорганизмите се съхраняват непосредствено в проби от тъкани, което е важно, за да се наблюдава тяхното топографическо разпределение в тъканите или количествено измерване. Понякога, анализите на пробите се провеждат непосредствено под микроскоп (сканираща електронна микроскопия) за разглеждане на взаимодействието на микробни общности или изучаване на връзката между животни, растения и микробоценоза

4 въпрос: Обработка на проби. Фенотипно определяне на микроорганизми

Пробите, съдържащи микроорганизми много рядко съдържат такова количество от тях, което може да бъде изчислено, без да се прибягва до концентриране или разреждане на пробата. Концентрираните проби трябва да се разреждат до желаната гъстота на микроорганизмите, последвано от засяване в хранителни среди (преброяване на живите клетки). Разреждането на пробите се извършва обикновено в 10-кратна последователност, така че на повърхността на средата в Петриевата паничка да попаднат 50-200 клетки, които да образуват колония.При това е важно да се подбере разредител, така че концентрация на живите клетки могат да растат почти два пъти при посявка на почвени микроорганизми от една и съща проба, ако ние използваме различни солеви разтвори за разреждане.. Разредените проби трябва да бъдат концентрирани преди посявката. За това се използват центрофугиране или филтруване чрез мембранни филтри с определени размери на порите.

Ако е важно да се определи броят на живи микроорганизми в пробата по време на нейното събиране, е необходимо да се разгледа възможността за размножаване на клетките в пробата по време на съхранение или транспорт (феномен, известен като
"ефект на бутилката" и е особено важен за преработка на проби от морска вода , лишени от тяхната естествена абсорбираща повърхност). Когато една проба от морската вода се намира в стерилни съдове, хранителни вещества от водата се абсорбират върху вътрешната повърхност на съда, повишавайки локалната концентрация на субстратите и става атрактивна за микроорганизмите, които също се адсорбират върху стените на съда и като последица от повишената концентрация на субстрати започват бързо да се размножават. От друга страна, условията за съхранение на събраните проби може да доведе до загуба на популациите от микроорганизми и да причинят понижаване на общата микробна численост

При разреждане на проби от микроорганизми следва да бъдат разпределени в обема на пробата равномерно. Това е трудна задача,особено при обработката на проби от почвата или утайката, в която микроорганизмите са склонни да се прикрепят към частици (органични и минерални) Степента на десорбция на клетките с частиците до голяма степен зависи от концентрацията на суспендиращия разтвор и неговия химически състав, е също така и от часа, температурата и сила смесване. Процесът на оптимална десорбция на клетките с частиците зависи силно от състава на пробата и следователно са нужни абсолютно стандартизирани методи за подготовка на проби за посявка.

При концентрираните проби, видно място играят избора на филтри, като филтри с малки пори бързо се запушват и не дават възможност за филтруване на проба от достатъчен обем, както и филтри с широки пори могат да прескочите някои от клетките. Поликарбонатните филтри са за предпочитане пред нитроцелулозните филтри с по-голяма плоска повърхност и повече унифициране на пробите. Химичният състав на материала на филтъра също оказва влияние върху преживяването на микроорганизмите.

Неспазването на условията , при обработка на пробата , необходими за определени физиологични групи микроорганизми може да промени съществено резултата на анализа. Така, обработка на проби за разкриване на строги анаероби изисква всички разреждания в разтвори да са без кислород и посявка на проби в безкислородна атмосфера. За разкриване на психрофилни микроорганизми всички стъклени съдове и течностите, които са в контакт с пробата, трябва да се охлаждат за максимално запазване на жизнеспособността на клетките на психрофилите.

Ако пробите не са предназначени за определяне на броя на живите и мъртвите клетки, те често се фиксират с формалдехид или глутаров алдехид веднага след избора. Такива препарати са готови за директна микроскопия.

При събирането на вирусни частици от природни проби е необходимо да се използват специални методи на концентрацията им. Вируси от водни проби могат да бъдат концентрирани при нееднократна абсорбция / елюция на подкиселени проби, при пропускането им през епоксидни или нитроцелулозни филтри. . Процедурата може да се повтори нееднократно , хилядократно концентрирайки вирусни частици, например от морска вода или проба от утайки.

Фенотипно определяне на микроорганизми

При чашечния метод на засяване на природните проби могат да се постигнат два резултата, за да получат отделни колонии от чисти култури на микроорганизми ( клонинги на една клетка) и да се започне фенотипно определяне на различни организми (описание на колонията). В някои случаи, отделни клетки от колонии могат да бъдат въведени в пластинки за анализ (API-тест, Biolog), по резултатити на които може да се определят микроорганизмите ( до род).

Изолиране и идентифициране на членовете на микробната общност по метода на директна посявка в чашата е ефективно при висока концентрация на клетките на този или онзи член на съобществото. Ако относителното количество на клетките от желания вид е малък, те могат да "изчезнат ", при този метод на обработка на проби и в този случай методът на директна посявка в чашата с разредени проби е неподходящ за анализ.

Тъй като различни членове на идентифицируемо микробно съобщество могат да наложат различни изисквания към компонентите на околната среда (състав и съдържание на соли, органични субстрати), както и физически условия за отглеждане (температура, влажност, съдържание на кислород и т.н.) за по-добро определяне на членове на съобществото се използват паралелно посявки в среда, с различен състав (например, за разкриване на копиотрофи и oлиготрофи, oрганотрофи и литотрофи, азотфиксатори и т.н.). Има методи за добавяне към средата на специфични инхибитори, които да потискат развитието на тези или онези групи микроорганизми (напр. актидион потиска развитието на еукариотната клетка в чаша с прокариоти.

5 въпрос: Определяне на микроорганизми чрез химически методи. Анализ на микроорганизмите по техния липиден състав. Определяне на отделни гени и геномни последователности

Анализ на микроорганизмите по техния липиден състав
Липиди - задължителни компоненти на мембраните, които са около цитоплазмата на всяка микробна клетка. Липидният състав на различните микроорганизми в значителна степен се различива един от друг. Съществуват 6 (дори повече) класа на липидите открити в микроорганизмите, всеки от които се състои от индивидуални липиди с шест или повече структурни характеристики. Всеки микроорганизъм има своя липиден профил (основни липиди) и това свойство е заложено в основата на химичната идентификация на микроорганизмите, основана на състава и съдържанието на липиди в клетката. Следва да се отбележи, че този метод не е перфектен, защото всеки микроорганизъм може съществено да промени липидния си профил, в зависимост от възрастта на културата и условията за култивиране на клетките.

Анализът, основан на проучване и сравнение на метилови естери на мастни киселини (MEМK), влизащи в състава на липидите, е получил широко разпространение поради своята простота и достъпност. Пълният процес на идентификация включва естерификация на липидите, метилиране на влизащите в техния състав мастни киселини и разделянето им на хроматографски колони и количествено определяне с помощта на газова хроматография или високоефективна течна хроматография (ВЕТХ). Специално обработени колони предоставят добра резолюция на MEМK, която позволява да се сравнят техните времена на задържане, с предварително идентифицирания липиден профил (стандарти). Количеството на всяка мастна киселина може да бъде изчислено по площта на хроматографския връх, а абсолютната концентрация определя въвеждането на вътрешен стандарт.




Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Екологична микробиология 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.