Екологична микробиология


Категория на документа: Биология


Анализ MEМK, извлечена от почвени проби, позволява бързо и сравнително евтино определяне на състава на популацията на почвените микроорганизми. Интерпретацията на резултатите в някои от случаите е затруднена, заради еднаквостта на много от липидите на различните представители от изследваните микробни съобщества.

Определяне на отделните гени и геномни последователности

С откриването на отделни гени или специфични геномни последователности са свързани преди всичко възможностите за анализ на микробни съобщества, без изолация и идентификация на нейните членове в чисти култури. Методите се основават на екстракция ( извличане) от почва, утайки или водни проби на общата ДНК, нейното пречистване и анализ чрез гел - електрофореза – термическа и денатурираща ( ТГГЕ/ДГГЕ )Основната трудност при извличането на ДНК е отделянето и пречистването й от хумусните вещества на почвата. Въпреки това, методите позволяващи такова пречистване, постоянно се усъвършенстват.

След извличането, ДНК се подлага на имобилизация с нитроцелулозен или найлонов филтър, топене и хибридизация с известна последователност на гените, отговорни за синтеза на някои специфични ензими. Така, при наличие в извадката на общата ДНК на гени, хибридизирани с гени, кодиращи нитрогеназа, показва наличието в анализираното съобщество на азотфиксатори, гени на метанмонооксигенази - метанотрофни, гени на РуБисКо - автотрофни микроорганизми, фиксиращи въглероден диоксид чрез цикъла на Калвин. Разчетени са вече няколко десетки гени, кодиращи ключови реакции на някои процеси, и с прилагане на метода на хибридизацията, ние можем да правим изводи за наличието на някои микроорганизми в проба, която анализираме.

Метод ПЦР дава възможност за идентифициране на непознати микроорганизми, намиращи се в естествената проба, без отделяне на чисти култури. Разработени са "универсални" грундове за бактерии, архебактерии и еукариоти, което позволява определени специфични последователности на тези три групи от микроорганизми да се разделят като се използва TГГE / ДГГE метод (термична и денатурираща електрофореза) и тогава, след повторно усилване на отделни групи, се получава почти пълен профил на микробната общност с идентификация на отделните филогенетични линии и класификация на микроорганизмите, основава на последователности на I6S рРНК.

За идентификация на микроорганизми в съобществото се използват гени-репортери , които могат да се открият лесно след проведени химически реакции ( lac Z-ген, който кодира бета-галактозидазата и xyl Е-ген, който кодира синтезата на ензими от метаболизма на толуол) или след експресии в клетката, изпускането на светлина с различни дължини на вълните (/ lux-гени или GFP-ген, кодиращ синтеза на зелен флуоресциращ белтък).
Гените-репортери , се използват обикновено за откриване на определени активности в природните проби при определяне на преживяемостта на микроорганизмите въведени в модела на микроорганизмите, за откриване на експресията и изучаване на активността на гена / ензима, под контрола на чийто промотор се експресира и ген-репортера . Генетичната структура в този случай изглежда и работи по следния образец. Ако нужният ген се експресира и ферментът изпълнява своята функция (например разцепва някой ксенобиотик ) то по луминесценцията на гена - репортер може да се съди от разстояние (например, в по-дебелите почви светлината от местата на реакция се предава в такъв случай с използването на оптично влакно. По изгасването на луминесценцията в генно - инженерните щамове E.coli съдят за токсичността на водните или почвени проби.

6 въпрос: Определяне числеността на микроорганизмите.
Определяне на микробната биомаса ( състав на АТФ, състав на компонентите на клетъчната стена, измерване количеството на хлорофила, определяне концентрацията на ДНК, състав на белтъци и липиди. Физиологични методи

Когато се работи с чисти култури, определянето на количеството микроорганизми не предизвиква затруднения. Друго е, когато е необходимо да се определи броя на микроорганизмите в природните образци, защото микроорганизмите в тях са изключително разнообразни. Методите, използвани за преброяване на вируси, бактерии, гъбички, и първаци ( едноклетъчни организми), са различни. Специална техника се прилага за изчисляване на психрофили и строго анаеробните форми.

Съществуват два метода за преброяване на бактериите:

1) пряко преброяване на клетките под микроскоп и 2) непряко изчисляване след подрастването на твърди носители ( пресмятане на живите клетки ). Често се използва първия метод, при който обикновено не се прави разлика между живи и мъртви клетки ( по Виноградски). Методът може да бъде модифициран (видоизменен) с прилагането на флуоресцентен микроскоп и флуоресцентни диференциращи бои за изчисляване на живите и мъртви клетки в препарата. Клетките на микроорганизмите също така могат да бъдат изчислени и в определен обем от течна проба под светлинен микроскоп (камера Тома- Горяев, Петрова-Хаузер).

Понякога, за да определи скоростта на растеж на клетките се прилага метод за преброяване на делящи се клетки, при това бе показано, че този метод корелира със скоростта на синтез на РНК., измерена чрез включването на белязан аденин.

Броят на специфичните клетки на микроорганизмите в природни проби може да се установи с помощта на използването на техника с флуоресциращи антитела. Но за това е необходима предварителна подготовка, включваща отделянето на чисти култури от исканите видове и време за работа на специфичните антитела в такива клетки. Този метод позволява да се следи развитието на отделните микроорганизми в техните естествени местообитания (автоекология). Антителата са изключително специфични по отношение на избрания вид, така че като цяло прави този метод изключително точен инструмент за изследване. Модификация на метода се явява приложението на специфични флуоресциращи антитела, разработена във връзка с някои ензими, както и употребата на флуоресцентни генетични проби ( генни сонди), която позволява идентификация на микроорганизми със същите гени в популацията. В една и съща популация могат да се открият различни гени, имайки генетични сонди, флуоресциращи в различни цветове.

При пресмятане на живите микроорганизми след подрастването основно се използват два метода:
1 ) изчисляване по чашите с отгледаните колонии след съответните разреждания и
2 ) пресмятане по метода на пределното разреждане
И двата метода изискват разделяне на микроорганизмите преди посявката на индивидуални клетки, които после да произвеждат потомство. Прилагането на методите за изчисление с посявки, изисква внимателно отнасяне с пробите, за да се съхрани жизнеспособността на клетките. Трябва да се има предвид, че за преброяването на микроорганизмите от различни групи следва да се прилагат различни среди, от които са разработени повече от хиляда за разкриване на бактерии, архебактерии, гъби, водорасли, първаци, аероби и анаераби.

За идентифициране на отделните групи микроорганизми се използват селективни и диагностични среди, среди с антибиотици, които специфично потискат развитието на отделни групи микроорганизми.

Модификация на метода е, хибридизация на колониите, при която от хиляди колонии, отглеждани върху чашата, може да се идентифицира една, която специфично се хибридизира с избрания ген – маркер.. Методът позволява да се изчисли броят на микроорганизмите от желания вид или с необходимата функция (в зависимост от приложението на гена за хибридизация) сред голямото количество микроорганизми в природните образци.

Определяне на микробната биомаса

Измерването на биомасата се използва за изчисляване добива на микроорганизмите, разбирайки под биомаса сухата маса на органичния материал, изразено в единици за маса. Измерване на биомаса в природните проби често не води до точни резултати, благодарение на големия брой нежелани ефекти, свързани с вземането на проби и измерване. Ето защо, най-приемливите методи за определяне на биомаса в природни образци са методите, свързани с определяне на биохимичните параметри на клетките. За такива измервания се предполага, че броят на измеряемите компоненти на клетките е един и същ за всички видове клетки, което, разбира се, е идеализирано. Поради това, измерването на биохимичните параметри на биомасата трябва да се екстраполира с повишено внимание.

Най-популярният метод за измерване на биомаса е да се измери съдържанието на АТФ и общото съдържание на адениновите нуклеотиди с последващо повторно преброяване на съдържанието на въглерода в клетките или на масата на сухото вещество. Методът позволява бързо и точно (с луциферин/ луциферазна проба) да се измери съдържанието на АТФ в пробата, тъй като количеството на АТФ строго съответства на биомасата на живите клетки, както и след смъртта на клетката количеството АТФ в него рязко се намалява или изчезва напълно.Общото количество на аденилатите (AT = АТФ + АДФ + AMФ ) не зависи от метаболизма на клетките и в по-голяма степен съответства на съдържанието на биомаса в анализираната проба

Друг метод е да се измери съдържанието на компонентите на клетъчните стени (например, ацетилмураминова киселина (МК) или липополизахаридите). При оценяването на съдържанието на мураминовата киселина нея я хидролизират за освобождаването на лактат, който се определя ензиматически. Установено е, че всички грамположителните бактерии съдържат 44 мкг МК / мг С в клетките, докато за грамотрицателните клетки това съотношение е равно на 12 мкг / мг. За оценка на съдържание на биомасата на гъби, се използва определянето на концентрацията на хитин, но на точността на метода се отразява броя на почвените членестоноги и насекоми.

При липса на растения в пробата може да се определи биомасата на фототрофните водорасли и бактерии, чрез измерване на количеството хлорофил. По концентрацията на хлорофил а съдят за съдържанието на биомасата на водорасли и цианобактерии след извличането от пробата чрез хлороформ/метанолова смес, с последващо измерване на поглъщането при 665 нм. Поглъщането на същия екстракт, измерено при 850 нм, ще отразява количеството на всички бактериохлорофили, като по този начин оценяват количеството на пурпурните фототрофни ( фотосинтезиращи) бактерии. Съдържание на различни хлорофили може да се измери и по спектрите на флуоресценция.

Концентрацията на ДНК в клетките на микроорганизмите е доста постоянна , така че нейното определяне също може да способства за измерване на биомасата. При природни образци, където чувствителността на метода за идентификация на ДНК е от първостепенно значение, използват проби с флуоресцентни бои, като тези етидиум бромид или Hoechst 33258 с използване на спектрофлуорометрия. Преди измерването трябва внимателно да се проведе очистване на общата ДНК., а също е необходим и контрол за наличието на еукариотна ДНК.

Белтъците е лесно да се определят, а бактериалните хемопротеини имат характерна хемилуминесценция. При определяне на белтъците трябва да сте убедени, че фоновите концентрации на белтъци са незначителни. Тъй като различните микроорганизми съдържат различни количества белтък, определянето на този компонент от биомасата е целесъобразно да се проведе в ситуации, когато в пробата се намират един вид микроби.

Наличието на липиди е добър маркер за определяне на биомасата, тъй като всички клетки са заобиколени от мембрани, съдържащи липиди. Количеството на ергостерол в пробата отразява съдържанието на гъби, тъй като той практически не се съдържа в растения, нито в архебактерии и бактерии. Определянето на концентрацията и състава на метиловите естери на мастни киселини на фосфолипидите, позволява заедно с оценката на общата биомаса да се намери и концентрацията на определена група на микроорганизми в пробата, взета от естествени ниши.




Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Екологична микробиология 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.