Ензимология


Категория на документа: Биология



Ш У М Е Н С К И У Н И ВЕ Р С И Т Е Т
"ЕПИСКОП КОНСТАНТИН ПРЕСЛАВСКИ"

КУРСОВА РАБОТА

по

ЕНЗИМОЛОГИЯ
ТЕМА:Производство на ензими, разграждащи скорбялата. Амилази, глюкоамилази,глюкоизомерази, пупуланази,декстранази

Изготвил: Петя Пенева фак.№...... З. О.
"Екологични биотехнологии и контрол на храни

Проверил: доц. Ц.Иванова

2014

Животът зависи от добре организирани химични реакции. Много от тези реакции сами по себе си протичат твърде бавно, за да поддържат живота . Оттук природата е проектирала катализатори, които днес отнасяме към ензимите и които изключително ускоряват тези химични реакции. Днес ензимите продължават да играят ключови роли в производството на храни и напитки и са компоненти на голям брой потребителски стоки. Производството на ензимни препарати заема едно от водещите места в съвременната биотехнология и се отнася към подотраслите , чиято продукция непрекъснато нараства поради разширяване сферите на приложение на тези биопродукти. Ензимите представляват високо активни , нетоксични биокатализатори с белтъчен характер, които са широко разпространени в природата и без чието участие е невъзможно осъществяването на много биохимични процеси и живота като цяло. Живата материя се разглежда като проява на многообразни и многобройни ензимни реакции, без които е немислимо протичането на катаболитните и анаболитните процеси, активният транспорт на веществата през мембраните на клетките, интеграцията и регулацията на обменните процеси.

Ензимите са присъщи на живите клетки и се намират практически във всички растения, животни и микроорганизми. Тяхната биосинтеза е свързана с осигуряване на метаболизма на клетките и затова количеството им се определя строго от жизнените потребности на организма. Такива обекти не могат да се използват за получаване на ензимни препарати. Само някои растения и отделни органи на животни, в които се натрупват значителни количества определени ензими, както и редица микроорганизми, са източници на промишленото получаване.Източник на ензими, главно на амилази, е малцът, който представлява прорасли житни зърна. Протеолитичните ензими папаин, фицин и бромелин се получават от плодове на пъпешово дърво, листа на смокиня, стъбла и листа на ананас. От соеви семена се получава уреаза, а от рицинови липаза. Във всички месопреработвателни предприятия се събират органите, съдържащи ензими, консервират се и се използват за получаване на ензимни препарати. Такива суровини са задстомашната жлеза, съдържаща химотрипсин, трипсин, а-амилаза, липаза, колагеназа, лигавицата на свинските стомаси от която се получава пепсина и липаза, телешки и агнешки стомахчета, съдържащи големи количества ренин. Източници на голям брой индустриално получавани ензими са микроорганизми, които при специално създадени условия свръх синтезират тези биологично активни вещества. Промишлените микробни продуценти обикновено са получени чрез прилагане на селекционно генетични подходи на работа с тях. Те могат да синтезират едновременно цял комплекс от ензими, но се срещат и такива, които натрупват само един промишлено важен ензим.

При производството им от растителни суровини и животински тъкани технологиите се свеждат до тяхното екстрахиране и пречистване от съпътстващите ги баластни вещества. Технологиите за получаване на микробни препарати са по-сложни, включват и култивирането на микроорганизмите, технологичният процес за получаването им включва три основни етапа:подготовка на посевен материал;производство и култивиране; след култивационна обработка за получаване на неперчистени или пречистени до различна степен ензимни препарати. Източниците на по-голяма част от индустриално получаваните ензими са микроорганизми, които при специално създадени условия свръх синтезират тези биологично активни вещества. Биосинтезиращата способност на продуцентите на ензими може да се повиши чрез прилагане на селекционно -генетични подходи, рекомбинантни ДНК технологии, както и чрез непрекъснато усъвършенстване на състава на хранителните среди и условията на култивиране. Ензимите, продуцирани от микроорганизми, се получават по повърхностния, твърдофазовия или дълбочинния метод на култивиране на продуцента на определен ензим, последния съставлява незначителна част от културалната среда, вследствие на което изолирането и пречистването му е трудоемък и скъп процес. Схемата за пречистване се определя съобразно предназначението на ензимния препарат и трябва да включва етапи с минимална загуба на ензимна активност.

Първите процеси, които хората са използвали от най-дълбока древност са ферментационните. С тях са се приготвяли различни продукти - хляб; пиво, вино, оцет, млечни продукти и др. С термина ферментация, който от латински значи "кипене" , "варене" са се означавали всички тези процеси, при които се отделя газ. Ферментацията е биологичен процес, дължащ се на живи организми. Ферментацията се явява неотменим елемент на техният живот. Бюхнер по експериментален път доказва, че ферментите са съставна част на живите организми, но действието им не зависи от тяхната дейност. За първи път терминът ензим е въведен от Вили Кюне, това е гръцка дума и означава "във дрожди". Школата на Пастьор разделя термините - фермент и ензим. Каталитичните функции се осъществяват от организирани или неорганизирани компоненти. Организирани са ферментите и те са в клетката, неорганизираните са ензимите - натрупани извън клетката или това са водни екстракти.

Практическото приложение на амилазните ензими, в частност на гликомилазните ензимни препрати, както и огромния потенциал в използването им в различни сфери на човешката дейност предопределят големия интерес към изучаването им.През 1914г. Kirchoff доказа, че нишестето се разгражда до захари не само при киселинен хидрилиз, но и ако към него се добави малцов екстракт или малц в изсушено състояние.Bajierinik през 1885 предлага ензимите, които катализират хидролизата на нишестето да се наричат "амилази". За пръв път глюкоамилазата е открита в плесенни гъби при получаване на етилов алкохол от Corman в 1948.През 1951 Philips и Caldwell наричат ензима получен от Rhizopus delemar - глюкоамилаза. От този момент въпросите свързани с намиране на нови, по-перспективни глюкоамилазни продуценти и оптимизиране на условията на биосинтез от отдавна известни продуценти на ензима са изключително актуални и на това се дължи научния и приложен интерес към тях. Амилолитичните ензими катализират хидролизата на гликозидни връзки в молекулата на скорбялата, гликогена и сродните полизахариди Скорбялата (нишесте) и целулозата са широко разпространени в природата въглеродни източници, които поддържат повечето форми на живот. Тези полимери са изградени от глюкозни единици, които иман различни конформации, така че са необходими различни ензимни системи, за да ги изграждат. Ензими способни да хидролизират нишесте се откриват при животни, растения и микроорганизми. Свойствата на тези ензими се различават в широки граници.
КЛАСИФИКАЦИЯ НА ЕНЗИМИ
В 6 класа:3.2.1.1. ά - амилаза 3.2.1.2 β - амилаза Първа цифра е класа, втората е подклас, третата - подподклас При ензимните препарати тази класификация не е коректна, защото те може да съдържат повече от 1 или 2 ензима. Ето защо Жак Дюкло предлага наименованието на ензимни препарати да се образува като към субстрата се прибавя начина на действие, наименованието на ензима, плюс - аза - например целулаза. Правят се опити в наименованието да намери място водещият ензим, да се даде информация за продуцента като родово и видово име, да се включи елемент от начина на култивиране на продуцента и да се покаже дали препарата е технически (непречистен), частично пречистен или високо пречистен. Например амилосубстилин Д3Х - Bac. Subtilis:І- амило (водещ ензим);ІІ- субстил (продуцент); ІІІ - ин (за благозвучие) ;ІV - Д (начин на култивинаране - дълбочинно);V - 3Х (степен на пречистване - непречистен) АмилоІризІин - П10Х - Asp. Oryzae ПротоІсубтилІин - Д20Х - B. subtilis ПротоІнигрІин - П- 25Х - Asp. Niger ХВП: 3Х - технически ; 10Х - частично пречистен чрез ултрафилтрация 20Х, 25Х - мелекулно - ситова хроматография (начин на пречистване) за аналитични цели или медицински.
ХАРАКТЕРИСТИКА НА СУБСТАТА - (C6H10O5)n НИШЕСТЕ/СКОРБЯЛА/Скорбялата е хомополизахарид, изграден от глюкозни остатъци, свързани чрез О- гликозидни връзки. Тя съществува под формата на неразтворими гранули, с характерна структура и размери, в зърнени суровини- пшеница, ечемик, ориз, ръж, царевица и много кореноплодни- цвекло, картофи и др. В сурово състояние нишестените гранули имат овална форма с неправилни контури и са с дължина между 1 и 100m. гранулите се придържат заедно с вътрешни водородни връзки и могат да абсорбират много малко количество вода.В химично отношение скорбялата не е изградена от един полизахарид, а от два- амилоза и амилопектин. Те се получават като две фракции при обработка на скорбялата с гореща вода. В различните източници съотношението им варира, но обикновено е 20-30% амилоза и 70-80% амилопектин. Основно градивно звено на веригата на двата полимера е малтозната единица:
Фиг.1.Структура на
малтозна единица

Амилозата е линеен хомопилизахарид, изграден от 200- 3000 глюкозни остатъка, свързани с -1,4- гликозидни връзки. Тя има молекулна маса 50-200kD и е водоразтворима. Свойствата на амилозата се обясняват със структурата й, която приема различна конфигурация в зависимост от услвията. Във вода се нагъва така, че наподобява наедрено статично кълбо. При добавяне на коплексообразуващ агент в разствора, амилазата формира двойноспирална кристална структура. Един спирален ход е изграден от шест D- глюкопиранозни остатъка. В следствие на това нагъване в молекулата се образува вътрешна кухина, в която могат да се внедрят различни молекули (йод, алохоли, мастни киселини). Получават се така наречените "съединения на включване". Когато в молекулата на амилозата се включат молекули йод се образува комплекс с характерно синьо оцветяване. На това свойство на амилозата се дължи реакцията между йода и нишестето, която се използва за количествено определяне на хидролираната скорбяла по калориметричен метод. Амилопептинът е силно разклонен хомополизахарид, в който основната верига е изградена от -1,4-свързани гликозидни остатъци, разклоненията следват на 17-25 остатъка се дължат на възникващите -1,6-гликозидни връзки. Амилопептинът с молекулна маса 60-65kD. Във вода е по-слабо разтворим от амилозата и за разлика от нея в гореща вода набъбва. При взаимодействие с йод получения продукт е с кафяво- виолетово оцветяване.

ХИДРОЛИЗА НА НИШЕСТЕ Нишестето може да се подложи на киселинна хидролиза за получаване на нискомолекулни продукти. Процесът протича при различни условия в зависимост от произхода и сруктура на нишестето. При киселинна хидролиза най-често активният агент е сярна киселина с различна концетрация. За хидролиза на нишесте до олиго- и монозахаридни продукти, могат да се прилагат и ензимни методи. Използването на ензими за тази цел е предпочитано пред химичната деградация поради високата специфичност на ензимното действие, еднаквите крайни продукти, меките реакционни условия, по-ниската енергитична потребност, отсъствие на нежелани страанични реакции и висока ефективност на процеса.
АМИЛОЛИТИЧНИ ЕНЗИМИ - КЛАСИФИКАЦИЯ, СВОЙСТВА, КАТАЛИТИЧНИ ФУНКЦИИЕнзимите които катализират хидролизата на нишестето се наричат амилолитични ензими или амилази. Според каласификацията и номенклатурата на ензимите (К.Н.Е.), те са групирани в клас 3- хидролази, подклас 2- гликозидази, подподклас 1- хидролизиращи О- гликозидни връзки (К.Н.Е. 3.2.1).
Фиг.2.Класификация на амилазите(по P. Nigam and D. Singht)

-амилаза (ендоамилаза, -1,4-D-глюкан-4-глюканхидролаза, диастаза, птиалин, декцтринизиращ ензим)К.Н.Е.3.2.1.1. -амилазата е ензим с ендо действие, което катализира с висока скорост случайни -1,4- гликозидни връзки в молекулата на амилопептина и амилозата, в резултат на което се получават главно нискомолекулни декстрини (малтотриоза, малтотетраоза, малтопентаоза, малтохексаоза, изомалтоза и др.). -амилазата се изолира от животински организми- от слюнка, панкреас; от растителни организми- малц от ръж, пшеница, ечемик; и от микроорганизми.

-амилаза (-1,4-D-глюкан-малтохидролаза, глюкогеназа, озахаряващ ензим К.Н.Е.3.2.1.2. -амилазата е ензим с екзодействие, катализирещ хидролизата на предпоследните -1,4- гликозидни връзки от нередуциращия край на амилазата и амилопептина. Крайните продукти са малтоза и сравнително неголямо количество декстрини. -амилазата се открива във висши растения и микроорганизми

Глюкоамилаза (-1,4-D-глюкан- глюкохидролаза,екзо--1,4-гюкозидаза, амилоглюкозидаза, - амилаза)К.Н.Е.3.2.1.3. Глюкоамилазата е ензим с екзодействие, който катакизира с висока скорост хидролизата на последната -1,4-гликозидна връзка в молекулата на амилозата и амилопектина от нередуциращия край. Като крайни продукти се освобожсават глюкоза и известно количество декстрини. Причини за непълния хидролиз на нишестето се явява наличието на съпътстващия ензим - глюкозилтрансфераза. Освободените глюкозни остатъци са с изменена конформация, което се дължи на осъществената по време на ензим-субстратното взаимодействие мутаротация. Глюкозният остатък от -аномерна форма преминава в -форма.Глюкоамилазата катазизира и -1,6-гликозидните връзки в молекулата на амилопектина, а също -1,3-връзките в млекулата на нигерозата, но с много ниска скорст. Според Коконашвали (1977г.) нишестето, гликогена, амилозата и амилопептина се хидролизират от ензима два пъти по-бързо, отколкото малтозата и -малтозата, а скоростта на хидролизата на захарозота е на порядък по- ниска от тази на нишестето. Скоростта на хидролизния процес зависи както от вида на връзките, така и от дължината на полизахаридната верига. Глюкоамилазата е широко разпространен ензим. Среща се при нисши и висши растения, в човешкия организъм и животните, а най-вече при микроорганизмите.

Пулуланаза (амило-1,6-глюкозидаза, дектрин-1,6--глюканхидролаза) К.Н.Е.3.2.1.41.Пулуланазата е ензим с ендодействие, катализиращ специфично хидролизата на -1,6- гликозидните връзки в молекулата на амилопептина.Ензимът има и трансферазно действие- когато някое разклонение в молекулата на пептина се скъси до 4- 5 остатъка, той пренася тези остатъци като цяло без един към други разклонения, а последния остатък отцепва, действайки като хидролаза.
Характеристика на ензима глюкоамилаза
За пръв път глюкоамилаза е открита в плесенни гъби при получаване на етилов алкохол от Corman 1948г. През 1951г. Philips и Caldwell наричат ензима получен от Rhizopus delemar - глюкоамилаза. С усъвършенстване на технологията и въвеждане на нови методи за изследване, информацията за този ензим непрекъснато расте. През 1992г. (Aleshin A) е публикувана структурата, получена на база на рентгено- структурен анализ на каталитично активния фрагмент на ензима глюкоамилаза от Aspergillus niger, направена при разделителна способност 2,2А. Състои се от тринадесет - спирали, дванадесет, от които се намират успоредно една на друга. Сърцевината на ензима е изградена от шест паралелни - спирали, образуващи цилиндър. Те се свързват с шест други периферно разположени - спирали. Последните са успоредни една на друга и антипаралелни на - спиралите, образуващи кората на ензима. Активният център се намира в сърцевината. Последните 30 аминокиселинни остатъка от полипептидната верига на ензима представляват отделен домен,съдържащ десет места за О- гликозилиране. Тези остатъци, както и 52 остатъка в N- терминалния край, образуват втория функционален домен, наред с каталитичния, а именно субстрат свързващия домен .
Естествен разсев за получаване на единични колонии.Като продуценти се използват щамове на А.niger, които синтезират основно глюкоамилаза, съпътстваща от а-амилаза. От 7-дневни развити култури върху скосен агар се приготвя спорова суспензия във физиологичен разтвор, която се филтрира през тръбичка с памучен тампон за разделяне на слепени спори. В суспензията се определя броят на спорите/куб.cm чрез броене с камера на BÜLKER. Коефициентът, по който се умножава средния брой конидии в 1 квадратче при тази камера е 2,5.10 5. В за висимост от броя на конидиите се прави разреждане на Пастьор, за да се получат единични колонии. От последните 3 разреждания се извършва посев с 0,1 куб.cm в по 3 петриеви панички с малцов агар. Пробите се термостатират в продължение на 2-3 дни при 30o С. Избират се панички, в които броят на колониите е 4-5 и на втория, третия ден, когато спорулацията е съвсем в началото, наблюдават се спори само в средата на колонията, последните се изолират в по 2 епруветки с малцов агар. Необходимо е да се изолират поне 20 колони, които се изпитват за активност чрез дълбочинно култивиране. На останалите прораснали колонии се прави морфологична и културална характеристика. За морфологичната характеристика се приготвят оцветени с метиленово синьо препарати. И се микроскопират с имерсионен обектив. Микроскопската картина дава представа и за базофилията на културата. Културната характеристика включва големина на колониите, форма, повърхност, радиална набразденост,ръб на колонията, степен на спорулация. Колонии, които показват отклонение от типичната културална характеристика, могат да са указание за настъпили генетични изменения. Хранителна среда с обем 50 куб.см се приготвя в ерленмайерови колби от 300 куб.см. Претеглят се малцовите коренчета за всяка ферментационна колба. В колба от 1,5куб.дм се дозират всички останали компоненти, необходими за 1куб.дм хранителната среда.За да се избегнат грешки при претеглянето на FeSO4.7H2O е необходимо да се приготви 1% разтвор на тази сол, от който се взема 1куб.см за 1куб.дм хранителна среда. Колбата се поставя на водна баня за разтваряне на компонентите, като се разклаща периодично, за да се избегне образуването на бучки от нишестето. След охлаждане се коригира рН на средата, което трябва да е 4,0±0,2. Средата се разлива по 50 куб.см в колби от 300куб.см, след което се стерилизира при 0,08 МРа за 30мин.След охлаждане хранителната среда се сее с 0,2 куб.см спорова суспензия от съответния щам A.niger. Развитието на продуцентите се извършва на клатачка с 23 rad/s при температура 30°±1°С за 72часа.След приключване на ферментацията културалната среда се окачествява най-напред чрез микроскопска картина на оцветен с метиленово синьо препарат за морфологично състояние на културата и отсъствие на странична микрофлора. След филтруване на бюхнерова фуния за отделяне на биомасата в културалната течност се определя стойност на рН, глюкоамилазна и а-амилазна активност.
ПОЛУЧАВАНЕ НА ТЕХНИЧЕСКИ ПРЕПАРАТ КОНЦЕНТРАТ НА ГЛЮКОАМИЛАЗА
При промишлено получаване на глюкоамилазни препарати от дълбочинни култури изискванията към тяхната чистота произтичат от предназначението им. В спиртната промишленост и животновъдството глюкоамилазата успешно се прилага като технически препарат, без да е необходимо отстраняването на съпътстващите я баластни вещества. Препаратите обаче, предназначени за озахаряване на нишестето, не трябва да съдържат глюкозилтрансфераза. За медицински цели ензимът се прилага във високопречистен и хомогенен вид. Сборната културална течност, получена след отделянето на биомасата на продуцента, се охарактеризира по следните показатели: обем, сурово вещество,рН, активност на глюкоамилазата, съдържание на белтък. Тя се подлага на вакумконцентриране при температура 30°С за приблизително 10-кратно намаление по обем, което корелира с постигнатото на 20-25% сухо вещество. При такова редуциране на обема пада утайка, която налага центруфугиране за 10мин. Към получения вакуумконцентрат се прибавя захароза като пълнител до получаване на сурово вещество 35-40%. Прибавят се също 0,1% К-сорбат като антисептик. Полученият препарат на глюкоамилаза се охарактеризира по същите показатели, както и културалната течност. На база на получените резултати се изчислява добивът на ензимна активност, съответно загубите на етап вакуумконцетриране, специфична активност на глюкоамилазата и степен на пречистване. Същите показатели може да се определят и за съпътстващата α-амилаза, което ще даде по пълна представа за качеството на препарата.



Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Ензимология 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.