Инициация на репликация


Категория на документа: Биология


 Прокариоти:

При прокариотите (E.coli) са открити пет различни ДНК полимерази. Всички те притежават полимеризационна и коректорска активност.

* ДНК полимераза I е изградена от една субединица. Притежава 3`-5` екзонуклеазна активност (редакторска). Тя се носи от т.нар. Кленов фрагмент, който се отделя от ензима при меки протеолитични условия. Характерно за ДНК полимераза I е, че носи 5`-3` екзонуклеазна активност (ник транслация). Останалите ДНК полимерази не проявяват такава активност. ДНК полимераза I добавя нуклеотиди към новосинтезиращата се верига с най-ниска скорост. Процесивността й в сравнение с останалите ДНК полимерази също е най-ограничена.

* ДНК полимераза II се състои от седем субединици. Притежава 3`-5` екзонуклеазна активност (редакторска), при нея липсва 5`-3` екзонуклеазна активност. Скоростта, с която катализира полимеризацията на нуклеотидите, е два пъти по-висока от тази на ДНК полимера I, но въпреки това е значително по-ниска от тази на ДНК полимераза III. Процесивността на ензима също е значително по-висока от тази на ДНК полимераза I. ДНК полимерази II, заедно с ДНК полимераза IV и V участват в репарацията на ДНК.

* ДНК полимераза III е изградена от над десет субединици. Проявява 3`-5` екзонуклеазна активност (редакторска), но не притежава 5`-3` екзонуклеазна активност. Скоростта, с която добавя нуклеотиди, е най-висока в сравнение с тази на останалите ДНК полимерази. Освен това този ензим се отличава с изключително висока процесивност. Полимеризационната й активност се носи от α-субединицата. ε- субединицата проявява редакторската активност. Двете субединици заедно формират коровата полимераза, която може да катализира реакцията на полимеризация, но с много ниска процесивност. Две такива корови полимерази могат да се свържат помежду си с помощта на т.нар. Clamp-loading или γ-комплекс. Този комплекс се състои от четири различни типа субединици τ2γδδ`. Свързването на двата корови комплекса се осигурява от τ-субединицата. χ и ψ са допълнителни субединици, които се свързват към клампиращия комплекс. Процесивността на ДНК полимераза III се повишава с добавянето на β-субединицата. С добавянето на четири такива субединици към ДНК полимераза III се получава холоензим. Две такива субединици формират затворена структура, която не позволява ДНК полимеразата да се откачи от ДНК и по този начин увеличават процесивността на ензима.

В репликацията на прокариотите участват над 20 различни ензима и белтъчни фактори, всеки от които изпълнява специфична функция. Целият комплекс от тези молекули се означава като ДНК репликационна система или реплизома. Хеликазите са ензимни молекули, които се придвижват по дължината на ДНК и късат водородните връзки между двете вериги. По този начин осигуряват матрица за синтеза на новите вериги. Използват енергията от АТР. При отделянето на двете вериги една от друга по дължината на ДНК молекулата се генерира топологичен стрес. Той се неутрализира от действието на специфични ензими, известни като топоизомерази. Те освобождават възникналото напрежение в системата. Топоизомераза I генерира едноверижни скъсвания (никове), докато топоизомераза II - двойноверижни (освобождава молекулата от положителната свръхспирализация). Топоизомеразите притежават еднонуклеазна и лигазна активности. Отделените една от друга вериги се стабилизират с помощта на ДНК-свързващи белтъци (SSB-белтъци). За да започне ДНК полимеразата да синтезира ДНК, е необходимо праймерът да бъде локализиран до матрицата. Обикновено праймерът е РНКов и се генерира от ензима праймаза. По-късно праймерите се отстраняват и ДНК полимеразата запълва мястото. Никовете се зашиват с помощта на ДНК лигази.

Репликацията на ДНК протича в три етапа: инициация, елонгация и терминация.

Инициацията започва от точно определено място, което е известно като ориджин. При E.coli това място е извесно като oriC. Обхваща силно консервативни ДНК последователности - три тандемно повторени последователности от по 13 нуклеотида, следвани от четири региона от по 9 нуклеотида. Първоначално комплекс от четири до пет DnaA молекули се свързват с четирите консенсусни последователности от по 9 нуклеотида. След това белтъците разпознават и денатурират ДНК в областта на тандемните повтори от по 13 нуклеотида, които са А-Т богати. Този процес изисква АТР, както и присъствието на хистоноподобния белтък HU. След това белтъкът DnaC подпомага свързването на белтъка DnaB към разплетената област от ДНК молекулата. По една циклична хексамерна DnaB молекула се закача за двете вериги на ДНК и започва да действа като хеликаза. Осигуряват разтварянето на ДНK молекулата в двете посоки. Генерират се две потенциални репликативни вилки. Множество SSB молекули се захващат за едноверижните клонове на ДНК и ги стабилизират. ДНК гиразата (топоизомераза II) освобождава топологичния стрес.

Продължителността на репликацията зависи от степента на метилиране на ДНК, както и от взаимодействията й с плазмената мембрана. OriC участъкът се метилира от Dam метилазата, която метилира азота на шесто място в аденина в рамките на палиндромната последователност 5`ГАТЦ.

Етапът на елонгация обхваща синтезата на водещата и на изоставащата вериги. Синтезата на водещата верига започва със синтезирането на къс РНКов праймер от ензима праймаза. Дезоксирибонуклеотидите се добавят към праймера от ДНК полимераза III последователно. Скоростта на синтезата е спрегната със скоростта на разплитане на ДНК молекулата. Синтезата на изоставащата верига се огигурява от фрагментите на Оказаки. Синтезира се първоначално РНК праймер и подобно на водещата верига ДНК полимераза III се свързва към него и започва да добавя дезоксирибонуклеотиди. Сложността на синтезата се изразява във факта, че и двете вериги се синтезират от една и съща асиметрична ДНК полимераза III. Единият коров комплекс се използва за непрекъсната синтеза на водещата верига, докато другият се придвжва от един фрагмент на Оказаки към следващ от изоставащата верига (формира луп). DnaB разплита ДНК при движението си в посока 5`-3` по матрицата на изоставащата верига. Периодично ДНК праймазата се свързва с DnaB хеликазата и синтезира къс РНКов праймер. Поставя се нова β-клампираща структура в близост до праймера. Когато синтезата на фрагмента на Оказаки завърши, репликацията спира за момент и коровите субединици дисоциират от β-клампата и се свързват с нова такава. Инициира се синтеза на нов фрагмент на Оказаки. Целият комплекс, отговорен за координираната синтеза на ДНК в репликационната вилка, се означава като реплизома. РНКовите праймери от фрагментите на Оказаки се отстраняват с помощта на ДНК полимераза I, а полученият ник се съшива от ДНК лигаза. ДНК лигазите катализират формирането на фосфодиестерна връзка между 3`хидроксилна и 5`фосфатна група. Фосфатната група трябва да се активира чрез аденилиране. ДНК лигазите при бактерии използват НАД като кофактор.
Последният етап от репликацията е терминацията. Двете репликативни вилки на цикличната бактериална хромозома се срещат в терминиращия сайт (Ter). Той обхваща около 20 нуклеотида. Ter секвенции формират своеобразен капан за репликативната вилка, тъй като веднъж навлязла в тази област, не може да я напусне. Ter сайтовете действат като свързващи места за белтъци, наречени Tus. Tus-Ter комплексът е необходим поради факта, че едната репликативна вилка може да започне нов репликационен цикъл преди другата да е завършила своя. Следователно когато една от двете репликативни вилки достигне такъв комплекс, тя спира и изчаква другата. След като и другата достигне това място протича репликацията и на последните няколко стотин бази.
Еукариоти:

При еукариотите ДНК молекулите са сравнително по-големи по размер от тези при прокариотите. Освен това те са организирани под формата на комплексни нуклеопротеинови структури. В най-общ план репликацията на еукариотите протича по сходен с този на прокариотите механизъм.

Местата на инициация на репликацията (ориджин) се означават като автономномно реплициращи се последователности (ARS) или репликатори. Характерно за всички еукариотни организми е, че инициирането на репликацията изисква свързването на рапознаващ ориджина комплекс или ORC. Той се свързва с определени секвенции от репликатора. ORC взаимодейства с голям брой белтъци, включени в контрола на клетъчния жизнен цикъл. Такива са например белтъците CDC6 и CDT1, които подпомагат сглобяването на хетерохексамери от MCM2 и MCM7. МСМ комплексът действа като хеликаза. Аналог е на бактериалната DnaB хеликаза. CDC6 и CDT1 са аналози на DnaС - позиционират MCM комплекса в мястото на ориджина.

Скоростта на репликационната вилка е едва 50 нуклеотида в секунда, което е едва 0,5% от тази при прокариоти. Репликацията на човешките хромозоми протича в двете посоки и започва от множество ориджини, с което се компенсира ниската скорост на репликативната вилка.

И при еукариотите се различават няколко типа ДНК полимерази. Репликацията на ядрения геном се осигурява от ДНК полимераза α, но с участието на ДНК полимераза δ. ДНК полимераза α представлява мултимерен комплекс. Една от субединиците й притежава праймазна активност, а най-голямата от субединиците й - полимеразна активност. Полимеразата не притежава 3`-5` екзонуклеазна (редакторска) активност. Смята се, че ДНК полимераза α е отговорна за синтезата на късите праймери за фрагментите на Оказаки в изоставащата верига. След това тези праймери се удължават с ДНК полимераза δ. Последната се активира от специфичен ядрен белтък PCNA. Третичната му структура е близка до тази на ДНК полимераза III при прокариоти. Не е установена хомоложност в първичната им структура. ДНК полимераза δ притежава 3`-5` екзонуклеазна (редакторска) активност. Предполага се, че тя осъществява полимеризацията и на двете вериги.

Известна е и ДНК полимераза ε, която замества в някои случаи ДНК полимераза δ - при необходимост от репарация на ДНК. Вероятно тя е отговорна и за отстраняването на РНК-овите праймери след завършване синтезата на фрагментите на Оказаки.

RPA белтъците са еквивалентни на SSB белтъците при прокариоти. Rfc е клампираща структура за PCNA и благоприятства сглобяването на активния репликационен комплекс. Последният притежава значителна хомоложност с clamp-loading комплекса при прокариоти.

Терминацията на репликацията при еукариоти включва синтезата на специфични структури, наречени теломери, разположени в краищата на хромозомите. Обикновено се състоят от много тандемно повторени копия на къси олигонуклеотидни секвенции (ТГ в едната верига и ЦА в комплементарната). Дължината им варира няколко десетки при протозоите до десетки хиляди нуклеотидни последователности при бозайниците. ТГ веригата е по дълга от долната верига, при което се обособява едноверижен ДНК участък откъм 3` края. Краищата на линейните хромозоми не се дореплицират от ДНК полимеразите. ДНК репликацията изисква матрица и праймер, които в края на линейната ДНК молекула не могат да бъдат осигурени. Ако не съществуваше специфичен механизъм за реплициране на краищата, хромозомите щяха да се съкръщават при всяко следващо клетъчно делене. Ензимът теломераза решава този проблем.

Теломеразата е изградена от РНК и белтъчни компоненти. РНК съдържа около 1,5 копия на съответния ЦА теломерен повтор. Този регион действа като матрица за синтеза на ТГ верига на теломера. В този случай теломеразата действа като клетъчна обратна транскриптаза. Теломеразата се нуждае от свободен 3` край и се придвижва в посока 5`-3`. След удължаването на ТГ веригата, комплементарната ЦА верига се синтезира от клетъчната ДНК полимераза. При протозои, каквато е Tetrahymena, е доказано, че при загуба на теломеразната активност се стига до непрекъснато скъсяване на теломерните последователности и последваща смърт на клетъчната линия. Наблюдавана е зависимост между дължината на теломерите и клетъчното дълголетие при хората. При прокариотите теломеразата е постоянно активна и тя поддържа дължината на теломерите. В соматичните клетки липсва теломераза. Ако тя се въведе в соматични клетки in vitro, то активността й се възстановява.
Едноверижният регион се предпазва чрез свързването на спецфични белтъци. При вишите еукариоти с много дълги теломерни последователности едноверижният участък се отделя под формата на Т-луп. При бозайниците Т-лупът се свързва с два белтъка TRF1 и TRF2. Т-луп структурата предпазва 3` краищата на хромозомите от нуклеазно действие




Сподели линка с приятел:





Яндекс.Метрика
Инициация на репликация 9 out of 10 based on 2 ratings. 2 user reviews.